《食品科学》：中国检验检疫科学研究院吴亚君研究员等：麦卢卡蜂蜜植物源性成分鉴别方法的建立

  蜂蜜一直以抗菌、修复、调养而闻名于世，体外研究和局部使用均已证明蜂蜜对许多病原微生物具有抗菌修复作用，这种抗菌活性是渗透（吸水）、酸 度、过氧化氢和植物化学因子（如多酚）等作用的结果。由新西兰麦卢卡树产生的一种单花蜜——麦卢卡蜂蜜具有非过氧化氢抗菌活性（NPA）。另外，有研究证实麦卢卡蜂蜜还具有抗氧化、抗肿瘤以及抑制肿瘤细胞增殖、帮助伤口愈合和消炎等特性。因此麦卢卡 蜂蜜被认为具有较高药用价值而被喻为新西兰的“国宝”，其售价远高于其他蜂蜜。一些不法分子为谋取暴利，将麦卢卡蜂蜜掺假掺杂卡奴卡或其他蜂蜜，作为单一麦卢卡蜂蜜进行交易，因此开发廉价、快速的麦卢卡蜂蜜鉴别判定的方法具备极其重大意义。

  为此 中国检验检疫科学研究院的杨艳歌、王迎春、吴亚君等 开展了以下实验研究：1）比较市场常见的试剂盒、传统CTAB法以及MPI指定的DNA提取试剂盒对麦卢卡蜂蜜花粉沉淀的DNA提取效果；2）建立麦卢卡蜂蜜上清液DNA提取方法，以弥补以往研究仅对麦卢卡蜂蜜花粉沉淀做鉴别的不足；3）建立植物内参照、麦卢卡、卡奴卡3 种物种源性成分鉴别的real-time PCR方法，分析方法的特异性、灵敏度与检出限；4）比较本研究与MPI规定的方法对蜂蜜样品的检测效果。通过以上4 个方面的研究，建立了高效提取麦卢卡蜂蜜沉淀和上清液DNA的方法；提供了可快速、灵敏、准确鉴别麦卢卡蜂蜜植物源性成分的方法；并通过对比，证实了建立方法的可行性、准确性与等效性，以期为快速检测麦卢卡蜂蜜的真伪提供技术支撑。

  为了对蜂蜜样品的DNA进行质量控制，根据常见的蜂蜜为显花植物的特性，设计显花植物通用引物探针，对48 种植物进行real-time PCR通用性检测，结果显示，设计的ndhB基因显花植物引物探针可以对45 种显花植物扩增，扩增Ct值在14～28之间，表明通用性和覆盖性较好；银杏、松和绿藻无扩增，表明对裸子植物和原始植物特异性较好，故依此引物探针作为内参照进行蜂蜜样品DNA提取效果的质控检测，结果如图1A所示。

  以上述47 种植物为检验测试对象，分别对设计的麦卢卡和卡奴卡引物探针进行扩增，结果显示如图1B和图1C所示，这两组引物探针分别仅能对麦卢卡和卡奴卡进行相对有效扩增，Ct值分别为18.14±0.02和19.41±0.04，二者之间无交叉扩增，其他植物源成分无非特异扩增，说明设计的两组引物探针的特异性较好，能够直接进行蜂蜜样品中麦卢卡和卡奴卡成分的检测。

  将6 个质量浓度梯度的麦卢卡和卡奴卡DNA进行绝对灵敏度检测，结果显示6 个梯度均有明显的扩增，当DNA质量浓度为1 pg/μL时，尚有良好的扩增，此时平均Ct值分别为35.66±0.13、37.02±0.42、36.27±0.29，因此初步确定内参照、麦卢卡和卡奴卡的绝对灵敏度均为1 pg/μL，结果如图2所示。根据仪器自动生成的标准曲线、Y卡奴卡=-3.880X＋23.533，内参照、麦卢卡和卡奴卡引物探针灵敏度检测的扩增效率分别达100.298%、95.507%、81.019%，线，说明线性关系良好，结果可信。因此确定本研究设计的内参照、麦卢卡和卡奴卡引物探针检测的绝对灵敏度最低可达1 pg/μL。与MPI报道的检出限为3 fg/μL，Ct值为36的灵敏度相近。

  高效的DNA提取方法是保证real-time PCR检测结果准确的前提。实 验选用3 种提取方法：CTAB法、NucleoSpin食品基因组DNA提取试剂盒、天根植物基因组DNA提取试剂盒以及传统的CTAB法，与MPI规定的Geneaid蜂蜜基因组DNA提取试剂盒进行麦卢卡蜂蜜花粉沉淀DNA提取效果比较。从操作步骤和时间看，CTAB操作步骤最繁琐、耗时最长，天根、NucleoSpin和Geneaid提取流程相近，步骤较简单、耗时较短，对4 种方法提取流程的比较如图3所示。从扩增效率看，CTAB扩增效果最低，NucleoSpin的扩增效果最好，其次是Geneaid，再次是天根，扩增效果的比较如图4所示。综上，NucleoSpin操作步骤最简便，耗时时间比较短，提取效率较Geneaid高，因此对麦卢卡蜂蜜的DNA提取不用局限于MPI的规定，检验测试过程中选择满足需求的DNA提取方法即可。

  为对有可能添加麦卢卡花粉到非麦卢卡蜂蜜进行冒充的情况做鉴别，本研究又针对麦卢卡蜂蜜上清液建立了DNA提取方法。经实验，发现采用Promega WizardTM Magnetic食品DNA纯化系统可对麦卢卡蜂蜜上清液进行DNA提取，并采用该方法对MPI提供的15 份蜂蜜样品上清液进行DNA提取，并与MPI规定的Geneaid蜂蜜基因组DNA提取试剂盒的沉淀效果作比较，结果发现建立的蜂蜜上清液DNA提取办法能够成功将所有蜂蜜DNA提出，能够完全满足检验测试要求，但与沉淀的扩增效果相比，上清液扩增效果略低于沉淀，扩增Ct值在24～36之间，沉淀DNA扩增Ct值在22～32之间，扩增结果如图5所示。

  为分析本研究建立的方法对麦卢卡及卡奴卡蜂蜜检测的实际检出限，分别提取模拟制备的混合蜂蜜样品的上清液和沉淀DNA，并进行real-time PCR扩增，检测结果如图6所示。结果发现无论上清液还是沉淀，本研究建立的内参照、麦卢卡、卡奴卡成分检出限均可达0.1%。

  采用本研究建立的方法和MPI规定的麦卢卡蜂蜜DNA检测的新方法，对MPI提供的15 份蜂蜜进行DNA提取和扩增效果比较，详情见表2。检测结果为3 种DNA提取方法均可获得质量良好的DNA，本研究建立的方法和MPI规定的麦卢卡蜂蜜DNA检测的新方法检测结果一致，包括以下几种情况：1）3 份检出卡奴卡成分，其中1 份未检出麦卢卡成分，另2 份样品采用MPI方法平均Ct值为33.84±1.20和34.46±2.54，接近于MPI文件要求的Ct≤36.00的检测阈值，但其相对分析误差（RPD）分别为5%和14.76%，MPI文件规定测试结果RPD应小于5%，因此该结果应判为阴性。采用本研究方法，沉淀和上清液均未检出麦卢卡，因此这2 份样品非麦卢卡蜂蜜。2）1 份检出植物成分，但既未检出麦卢卡成分也未检出卡奴卡成分，为其他植物蜂蜜。3）9 份同时检出麦卢卡分和卡奴卡成分，为多花麦卢卡蜂蜜。4）2 份检出麦卢卡分而未检出卡奴卡，应为单花麦卢卡蜂蜜。综上，这15 份样品中，13.33%为麦卢卡单花蜜，66.67%为杂花蜜，13.33%为卡奴卡蜂蜜，6.67%为其他植物蜂蜜。

  在参与MPI麦卢卡蜂蜜DNA检测的新方法验证的过程中，发现一些问题：一是，DNA提取试剂盒和PCR试剂盒均需购买推荐厂商的商品，费用较昂贵，且这2 个商品非通用试剂，只能用于麦卢卡蜂蜜检测的，因此通常情况下国内没有现货，每次购买货期较长，影响了检测时效性。二是，未提供内参照、麦卢卡、卡奴卡3 种成分检测的引物探针序列，每次检测都需要购买指定的试剂盒，而无法自行合成，因此在使用的过程中受到诸多限制。三是，仅对蜂蜜花粉沉淀进行的检测，无法分辨以掺入花粉造假蜂蜜的方式。

  NucleoSpin食品基因组DNA提取试剂盒、Geneaid蜂蜜基因组DNA提取试剂盒、天根植物基因组DNA提取试剂盒、CTAB法4 种方法都能提出DNA，即在对麦卢卡蜂蜜检测的过程中并非必须用其指定的或进口的试剂盒，国产试剂盒和传统CTAB法也可满足规定的要求，若想获取高质量浓度的DNA，在使用的过程中可通过采用增加蜂蜜样品量，富集花粉沉淀的方法获取DNA，来提升检测效率。

  同时，本研究对蜂蜜沉淀进行DNA提取的过程中，还对部分步骤进行改良，即增加了对花粉沉淀水洗的过程。这是因为基因组DNA也是糖，将蜂蜜中富集的沉淀增加水洗的过程，可以尽可能去除蜂蜜中的糖分，以避免在DNA提取的过程中造成干扰，来提升DNA的提取效率。

  此外，为谋取利益，造假者可能将麦卢卡花粉添加到非麦卢卡蜂蜜中以假冒麦卢卡蜂蜜，所以仅仅对蜂蜜中的花粉沉淀进行仔细的检测尚有不足。为此，本研究还建立了麦卢卡蜂蜜上清液DNA提取方法，并通过对15 份蜂蜜样品的实际检验测试，证实本办法能够有效提出蜂蜜上清液DNA。但同时研究结果为，利用磁珠法提取的蜂蜜上清液的DNA扩增效率低于花粉沉淀，推测原因可能是蜂蜜样品中含有较多的糖分，会对磁珠溶液的分散体系造成影响，从而干扰了磁珠对DNA的吸附效率。但蜂蜜上清液DNA提取方法的建立弥补了以往蜂蜜蜜源植物成分溯源时仅对花粉沉淀进行仔细的检测的不足，从而能够分辨通过掺入花粉到糖浆中的造假蜂蜜。

  本研究建立了麦卢卡蜂蜜沉淀和上清液DNA提取方法，并建立了内参照、麦卢卡和卡奴卡植物源性成分real-time PCR检测的新方法。结果显示，内参照引物探针对显花植物的通用性、覆盖性和特异性较好，可作为内参照进行蜂蜜样品DNA提取的质控检测。麦卢卡和卡奴卡成分鉴别方法的特异性良好、灵敏度较高，绝对灵敏度最低可达1 pg/μL，对混合样品的检出限可达0.1%。同时与MPI方法比较，证实了本研究方法的可行性、准确性和等效性。本研究建立的方法不但可以用于麦卢卡蜂蜜的植物源灵敏、快速、高效的检测，还能鉴别以麦卢卡花粉造假麦卢卡蜂蜜的方式，同时还可解决以往对麦卢卡蜂蜜DNA检测需要依赖MPI官方指定检测的新方法的问题，为对国境口岸麦卢卡蜂蜜的质量监控提供了良好的技术支撑。